【產(chǎn)品信息】

• 實(shí)驗(yàn)原理

免疫組化，是應(yīng)用免疫學(xué)基本原理——抗原抗體反應(yīng)，即抗原與抗體特異性結(jié)合的原理，通過(guò)化學(xué)反應(yīng)使標(biāo)記抗體的顯色劑（熒光素、酶、金屬離子、同位素）顯色來(lái)確定組織細(xì)胞內(nèi)抗原（多肽和蛋白質(zhì)），對(duì)其進(jìn)行定位、定性及定量的研究，稱為免疫組織化學(xué)技術(shù)(IHC)或免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù)(ICC)。 

• 實(shí)驗(yàn)器材及試劑

1.主要實(shí)驗(yàn)器材

2.主要實(shí)驗(yàn)試劑

• 實(shí)驗(yàn)步驟
• 石蠟切片脫蠟至水：依次將切片放入二甲苯Ⅰ12min-二甲苯Ⅱ12min -無(wú)水乙醇Ⅰ6min- 95%酒精6min- 85%酒精6min，自來(lái)水洗2min。
• 抗原修復(fù)：組織切片置于盛滿抗原修復(fù)液EDTA(9.0)的修復(fù)盒中于微波爐內(nèi)進(jìn)行抗原修復(fù)，中火8min至沸騰停火8min再轉(zhuǎn)中低火7min，此過(guò)程中應(yīng)防止緩沖液過(guò)度蒸發(fā)，切勿干片。自然冷卻后將玻片置于PBS（PH7.4）中在脫色搖床上晃動(dòng)洗滌3次，每次5min。
• 阻斷內(nèi)源性過(guò)氧化物酶：切片加上3%的雙氧水，室溫孵育25min，將玻片置PBS（PH7.4）中在脫色搖床上晃動(dòng)洗滌3次，每次5min。
• 畫圈：用組化專用的組化筆沿著組織外圍輪廓畫一個(gè)與組織間隔3-4毫米的小圈，然后加入足量的PBS保證后續(xù)依次加入的封閉血清，一抗，二抗，以及顯色劑能完全覆蓋組織，而不沿著玻片流走。
• 血清封閉:在組化圈內(nèi)滴加3%BSA 均勻覆蓋組織，室溫封閉30min。
• 加一抗：輕輕甩掉封閉液，在切片上滴加按一定比例配好的一抗，切片平放于濕盒4°過(guò)夜孵育。
• 加二抗：玻片置于PBS（PH7.4）中在脫色搖床上晃動(dòng)洗滌3次，每次5min。切片稍甩干后在圈內(nèi)滴加與超敏兔鼠通用二抗（HRP標(biāo)記）覆蓋組織，室溫孵育50min。
• 顯色：玻片置于PBS（PH7.4）中在脫色搖床上晃動(dòng)洗滌3次，每次5min。切片稍甩干后在圈內(nèi)滴加解凍的TY反應(yīng)液反應(yīng)20min，然后PBS洗三次，之后加入紅色顯色液工作液（PB:CU:紅色色原：AC=860:40:1:100），顯微鏡下控制顯色時(shí)間，陽(yáng)性為紅色，純水沖洗切片終止顯色。(時(shí)間較長(zhǎng)15min左右)，再重復(fù)2-7的操作步驟。
• 抗原修復(fù)：組織切片置于盛滿抗原修復(fù)液EDTA(9.0)的修復(fù)盒中于微波爐內(nèi)進(jìn)行抗原修復(fù)，中火8min至沸騰?；?min再轉(zhuǎn)中低火7min，此過(guò)程中應(yīng)防止緩沖液過(guò)度蒸發(fā)，切勿干片。自然冷卻后將玻片置于PBS（PH7.4）中在脫色搖床上晃動(dòng)洗滌3次，每次5min。
• 阻斷內(nèi)源性過(guò)氧化物酶：切片加上3%的雙氧水，室溫孵育25min，將玻片置PBS（PH7.4）中在脫色搖床上晃動(dòng)洗滌3次，每次5min。
• 畫圈：用組化專用的組化筆沿著組織外圍輪廓畫一個(gè)與組織間隔3-4毫米的小圈，然后加入足量的PBS保證后續(xù)依次加入的封閉血清，一抗，二抗，以及顯色劑能完全覆蓋組織，而不沿著玻片流走。
• 血清封閉:在組化圈內(nèi)滴加3%BSA 均勻覆蓋組織，室溫封閉30min。
• 加一抗：輕輕甩掉封閉液，在切片上滴加按一定比例配好的一抗，切片平放于濕盒4°過(guò)夜孵育。
• 加二抗：玻片置于PBS（PH7.4）中在脫色搖床上晃動(dòng)洗滌3次，每次5min。切片稍甩干后在圈內(nèi)滴加與超敏兔鼠通用二抗（HRP標(biāo)記）覆蓋組織，室溫孵育50min。
• DAB顯色：玻片置于PBS（PH7.4）中在脫色搖床上晃動(dòng)洗滌3次，每次5min。切片稍甩干后在圈內(nèi)滴加（稀釋液和濃縮液1000:50配制）新鮮配制的DAB顯色液，顯微鏡下控制顯色時(shí)間，陽(yáng)性為棕黃色，純水沖洗切片終止顯色。
• 復(fù)染細(xì)胞核：蘇木素染色2-3mins左右，自來(lái)水洗，蘇木素分化液分化2秒，自來(lái)水沖洗，蘇木素返藍(lán)液返藍(lán)15-30s，流水沖洗。
• 脫水封片：將切片依次放入75%酒精5min-85%酒精5min -95%酒精5min -無(wú)水乙醇5min -二甲苯Ⅰ5min -二甲苯Ⅱ5min 中脫水透明，將切片從二甲苯拿出來(lái)稍晾干，中性樹膠封片。
• 顯微鏡鏡檢，圖像采集分析。
• 結(jié)果判讀：

蘇木素染出細(xì)胞核為藍(lán)色，DAB顯出的陽(yáng)性表達(dá)為棕黃色，紅色顯色試劑呈粉紅色

• 注意事項(xiàng)：

1． 注意切片脫蠟是否徹底；

2． 實(shí)驗(yàn)過(guò)程中切片勿干片；

3.  實(shí)驗(yàn)操作中小心槍頭掛傷組織。

2． 實(shí)驗(yàn)過(guò)程中切片勿干片；

3.  實(shí)驗(yàn)操作中小心槍頭掛傷組織。